反应机制虽然过氧化氢酶完整的催化机制还没有完全被了解，但其催化过程被认为分为两步：其中，“Fe()-E”表示结合在酶上的血红素基团（E）的中心铁原子（Fe）。Fe(IV)-E(.+）为Fe(V)-E的一种共振形式，即铁原子并没有完全氧化到+V价，而是从血红素上接受了一些“支持电子”。因而，反应式中的血红素也就表示为自由基阳离子（.+).过氧化氢进入活性位点并与酶147位上的天冬酰胺残基（Asn147）和74位上的组氨酸残基（His74）相互作用，使得一个质子在氧原子间互相传递。自由的氧原子配位结合，生成水分子和Fe(IV)=O。Fe(IV)=O与第二个过氧化氢分子反应重新形成Fe(III)-E，并生成水分子和氧气。[12]活性中心铁原子Chemicalbook的反应活性可能由于357位上酪氨酸残基（Tyr357）的苯酚基侧链的存在（帮助Fe(III）氧化为Fe(IV））而得以提高。反应的效率可能是通过His74和Asn147与反应中间体作用而得以提高。[12]该反应的速率通常可以通过米氏方程来确定。过氧化氢酶也能够氧化其他一些细胞毒性物质，如甲醛、甲酸、苯酚和乙醇。这些氧化过程需要利用过氧化氢通过以下反应来完成：同样，具体的反应机制还不清楚。任何重金属离子（如硫酸铜中的铜离子）可以作为过氧化氢酶的非竞争性抑制剂。另外，剧毒性的氰化物是过氧化氢酶的竞争性抑制剂，可以紧密地结合到酶中的血红素上，阻止酶的催化反应。处于过氧化状态的过氧化氢酶中间体的三维结构已经获得解析，可以在蛋白质数据库中检索到。